人成骨细胞与复合型多孔生物支架降解产物的相容性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.51.014

摘要/Abstract

摘要：

背景：以Ⅰ型胶原蛋白改性多孔硫酸钙生物支架在体内的降解过程尚不明确，其降解产物对人成骨细胞的影响国内外也缺少相关研究。
目的：观察人成骨细胞与硫酸钙/胶原膜复合型多孔生物支架降解产物的生物相容性。
方法：将第2代人成骨细胞分别置于硫酸钙/胶原膜复合型多孔生物支架降解产物浸提液及含体积分数10%新生牛血清DMEM培养液中培养，培养第1，3，5，7天以MTT法检测两组细胞增殖曲线，联合会推荐法测定细胞碱性磷酸酶活性，考马氏亮蓝微板法测定总蛋白。
结果与结论：在硫酸钙/胶原膜复合型多孔生物支架降解产物浸提液中培养人成骨细胞的增殖速度略高于在含体积分数10%新生牛血清DMEM培养液中培养的细胞，但差异无显著性意义(P > 0.05)。两组碱性磷酸酶活性、总蛋白合成及碱性磷酸酶/总蛋白都随时间递增而增加，两组不同时间点上述指标差异均无显著性意义(P > 0.05)。表明硫酸钙/胶原膜复合型多孔生物支架降解产物既不影响人成骨细胞的增殖生长，也不影响其正常生理功能，具有较好的生物相容性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 材料生物相容性, 组织工程骨材料, 人成骨细胞, 硫酸钙, 胶原膜, 复合型支架, 细胞相容性, 相容性研究, 降解产物

Abstract:

BACKGROUND: The degradation of a collagen Ⅰ modified porous calcium sulfate scaffold in vivo is unclear, and its degradation product effects on human osteoblasts are rarely reported.
OBJECTIVE: To observe the biocompatibility of human osteoblasts with degradation products of calcium sulfate/collagen membrane composite porous scaffold.
METHODS: Passage 2 human osteoblasts were cultured in the extract of degradation products of calcium sulfate/collagen membrane composite porous scaffold and in Dulbecco’s modified Eagle’s medium containing 10% newborn calf serum. At days 1, 3, 5, 7, cell proliferative curves and total protein were determined using 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide method and Coomassie brilliant blue micro-plate method, respectively. And alkaline phosphatase activity was also detected.
RESULTS AND CONCLUSION: The proliferation rate of human osteoblasts in the extract of degradation products of calcium sulfate/collagen membrane composite porous scaffold was slightly higher than that in the Dulbecco’s modified Eagle’s medium containing 10% newborn calf serum, but there was no significant difference (P > 0.05). Alkaline phosphatase activity, total protein synthesis and alkaline phosphatase/total protein were increased with time in the two groups, but there was no significant difference at different time (P > 0.05). These findings indicate that the degradation products of calcium sulfate/collagen membrane composite porous scaffold cannot influence proliferation and growth of human osteoblasts as well as their normal physiological functions, which have good biocompatibility.

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Key words: biocompatible materials, tissue engineering, collagen, histocompatibility

中图分类号:

R318

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Sun Jiang-wei, Wang Dong, Sun Hai-yu. Compatibility of human osteoblasts and composite porous bioscaffold[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(51): 8869-8874.

图/表（结果） 4

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引言

材料方法

设计：细胞观察实验。

时间及地点：于2012年2至7月在山西医科大学第二临床医学院完成。

材料：

实验方法：

松质骨取材：由于用人松质骨制备成骨细胞效果明显且方便快捷，患者髋、膝骨关节炎或股骨颈骨折的发病率也较高，因此实验采用的松质骨均取自患者关节置换中切除的股骨头、颈或股骨髁等，取适当大小后将其放入无菌瓶内^[3-4]。

成骨细胞的分离培养：将术中取出的松质骨送至实验室后放于盛Hank’s液的培养皿中，用眼科剪剪碎至 1 mm×1 mm×1 mm，除去骨上的血块和软组织，至肉眼无可见的软组织和血块附着。用Hank’s液反复冲洗至骨粒呈白色，吸去Hank’s液，将骨粒移至20 mL的烧瓶，加入0.25%胰酶消化液，在37 ℃恒温磁力搅拌器上搅拌30 min，加含体积分数10%新生牛血清的DMEM培养液2 mL，终止消化，用100目不锈钢筛过滤，弃去滤液。用上述方法再消化骨粒3次，每次搅拌后加含体积分数10%新生牛血清的DMEM培养液2 mL，终止消化，滤液盛于离心管，1 000 r/min离心10 min，弃去上清液，加含体积分数10%新生牛血清的DMEM培养液，作细胞计数，按约5×10⁷L^-1细胞浓度接种于培养瓶，标记接种时间，瓶盖微松，以备培养瓶内外气体交流，置于体积分数5%CO₂、37 ℃恒温培养箱中培养，至24 h细胞贴壁，更换含体积分数10%新生牛血清的DMEM培养液，以后一般每2 d更换含体积分数10%新生牛血清的DMEM培养液1次^[5]。

成骨细胞的鉴定：

形态学鉴定：用倒置相差显微镜观察培养的成骨细胞活体形态^[6]。

苏木精-伊红染色^[7]：将预先置入培养瓶中已生长有成骨细胞的玻片取出，用PBS(pH值7.4)冲洗3次，每次1.0-2.0 min。将玻片依次浸入体积分数95%乙醇固定 15 min、体积分数80%乙醇固定3 min、体积分数70%乙醇固定3 min、体积分数50%乙醇固定3min。PBS洗2次，每次1 min。加入苏木精染色液进行分色，数秒即可(稀盐酸乙醇溶液：用体积分数75%乙醇配制1%的盐酸)。自来水浸洗5 min。伊红染色5-10 min。自来水浸洗5 min。逐级脱水：体积分数70%，80%，90%乙醇各1次，体积分数95%乙醇2次，体积分数100%乙醇3次，每次1 min。树胶封固。镜下观察。

碱性磷酸酶染色：传代后的第10天成骨细胞长满培养瓶的壁和玻片，取出玻片，PBS冲洗后用冷丙酮固定10 min，蒸馏水冲洗数次，加入含2%巴比妥钠5 mL、3%β-甘油酸钠5 mL、2%氯化钙10 mL、2%硫酸镁 1 mL、蒸馏水10 mL的孵育液，37 ℃孵育4 h，自来水冲洗数次，加入2%硝酸钴反应5 min，蒸馏水漂洗数次，加入1%硫化铵反应2 min，自来水洗2次，干燥，透明，封固。观察染色效果，胞浆中出现黑色颗粒或块状沉淀为阳性^[8]。

碱性磷酸酶的生物学测定：取第2代成骨细胞，以5× 10⁷ L^-1细胞浓度接种于24孔无菌培养板，24 h后更换含体积分数10%牛血清的DMEM培养液，以后每3 d换含体积分数10%牛血清的DMEM培养液1次，至第8天成骨细胞长满培养板底吸去培养液，每孔分别加入无血清的DMEM培养液，放入含体积分数5%CO₂、37 ℃培养箱中培养24 h，收集上清液，用生化检测仪测定碱性磷酸酶活性。

硫酸钙/胶原膜复合型多孔生物支架的降解：硫酸钙/胶原膜复合型多孔生物支架是由医用硫酸钙支架和Ⅰ型胶原蛋白复合而成。该胶原膜有部分类似于天然骨的微结构成分与特征，同时具备了胶原蛋白膜的屏障作用和硫酸钙诱导新骨生成的作用。

复合Ⅰ型胶原多孔硫酸钙生物支架的制备：Ⅰ型胶原蛋白具有良好的组织相容性、低免疫原性与低抗原性，可改善支架的细胞黏附性，促进人成骨细胞的分化及增殖。将多孔硫酸钙支架浸于10 g/LⅠ型胶原溶液中，真空抽吸，冻干，自然降解3个月。

支架降解产物浸提液的制备：将降解后的支架用去离子水清洗3次，100 ℃真空干燥12 h，按样品质量和PBS(pH值7.4)的体积比为1 g/30 mL的比例将样品浸泡液置于密闭容器中，37 ℃恒温振荡。

人成骨细胞与硫酸钙/胶原膜复合型多孔生物支架降解产物的相容性研究：将已经培养好的第2代人成骨细胞以1×10⁸ L^-1的细胞浓度接种于24孔板中，每孔1 mL，将24孔板分为实验组与对照组。12孔实验组每孔加入 100 μL硫酸钙/胶原膜复合型多孔生物支架降解产物浸提液，12孔对照组每孔加入100 μL含体积分数10%新生牛血清的DMEM培养液，37 ℃恒温密闭培养，分别于第1，3，5，7，9天取两组各两孔作四唑盐比色法细胞计数，绘出细胞增殖曲线。使用国际临床化学联合会推荐法测定碱性磷酸酶活力，用考马氏亮蓝微板法测定总蛋白，计算出单位总蛋白碱性磷酸酶量，将结果做Wilcoxon配对法秩和检验。

主要观察指标：两组细胞的增殖、碱性磷酸酶活性及总蛋白检测结果。

统计学分析：采用SPSS 12.0统计软件包进行Wilcoxon配对法秩和检验。

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讨论

近些年来在临床上，骨科诊断治疗中经常会出现由于肿瘤或囊肿切除、创伤、感染、先天性疾病、手术、骨折不愈合等形成的缺损区，这些缺损区的存在导致病变处生物力学环境的改变，功能失用或引起感染成为慢性骨髓炎等疾病，对患者的生活造成了非常不良影响[9]。在治疗中需要使用一些骨组织替代物来填充已形成的缺损，恢复病变处的外形、力学强度和生理功能，消灭死腔，减少术后感染等^[10] 。
所以，对于骨组织替代物或支架的研究成为目前的热门课题。组织工程目前主要的骨替代材料有：①自体骨：效果最好，但来源非常有限，会造成新的创伤。②同种异体骨：容易发生免疫排斥反应且来源有限，可能传播疾病且受伦理学的影响。③复合人工骨：来源广泛，目前已显示出良好的研究和应用前景，但需要进一步临床检验。④组织工程化骨：是在复合人工骨的基础上的改进，组成成分包括有载体、诱导成骨因子、种子细胞，接近自然骨，从修复能力来看，组织工程化骨已可以通过基因工程技术来促进骨折修复^[11-12] 。并且人们普遍认为理想的骨替代材料应具有以下特性：材料表面结构及性质有利于细胞吸附、增殖和分化；可按控制的速度进行降解；良好的生物相容性；容易制成三维多孔状及易加工成不规则的几何形态；具有一定的机械强度，能够支持生理压力；能保持对细胞的分化，不会使细胞产生变异^[13-14] 。而现如今还没有一种材料能满足以上所有要求。但随着材料学、组织工程学的飞速发展，各种新型的骨组织工程领域材料支架不断出现，骨缺损修复前景将会是非常乐观的^[15] 。
目前骨组织工程多孔生物支架材料的制备方法及过程在国内已基本成熟，采用的支架材料主要有人工合成材料和天然生物衍生材料及复合材料，其中以聚乙酸、聚乳酸、磷酸三钙、羟基磷灰石等较为常用^[16] 。人们通过深入研究发现上述几种材料在进一步的研究过程中生物降解性和成骨作用都有不足之处：聚乙酸、聚乳酸虽然具有较好的生物相容性、可降解性和可吸收性，但存在费用昂贵、可塑性差等缺点，而且降解后的酸性代谢产物会降低聚合物周围的pH值，影响细胞和组织的生长，还可引起纤维化及发生周围组织的免疫反应；羟基磷灰石存在植入后难以吸收替代，长期滞留于体内妨碍骨组织的改建和完全修复等缺点^[17] 。所以实验选择另一种材料——医用级硫酸钙支架。
医用级硫酸钙是一种骨引导性材料，主要作为空隙的填充物，它能恢复骨的形态轮廓，阻止软组织长入，它为血管和成骨细胞的长入提供了骨引导性基质。当医用硫酸钙被吸收时，新骨塑性并恢复解剖学特点和结构特性^[18] 。医用硫酸钙支架孔径分布在150-300 μm之间，孔洞之间互相连通，而且材料内部微孔丰富、分布均匀，呈现疏松珊瑚状结构，这种结构类似于生物活体的松质骨构架，它有利于骨组织的长入和材料自身的生物降解。经过相关测试计算，多孔支架平均孔隙率为62.59%-79.36%，抗压强度为27-53 MPa(正常人体骨组织的生物力学强度松质骨为7.09 MPa、密质骨177-221 MPa)，其最重要的优点是其自然吸收速度与新骨形成速度相当^[19] 。随着医用硫酸钙植入物的吸收，新骨也逐渐恢复解剖性质及结构特点。医用级硫酸钙/胶原膜复合型多孔生物支架是由医用硫酸钙支架和Ⅰ型胶原蛋白复合而成，该胶原膜有部分类似于天然骨的微结构成分与特征，同时具备了胶原蛋白膜的屏障作用和硫酸钙诱导新骨生成的作用，Ⅰ型胶原蛋白涂层于支架材料的微孔表面以后，成骨细胞在其表面显现出良好的黏附性和增殖活性，所以Ⅰ型胶原蛋白可作为骨黏附分子和骨特异性生长因子的良好载体，它与基质材料复合构建的支架具有很好促进新骨组织形成的能力^[20] 。但此种复合物在体内降解过程并不十分明确，并且其降解产物对人成骨细胞的影响研究也较少，故实验从此处入手。
现阶段，体外细胞复合培养法是一种评价支架生物相容性的重要方法。实验取材来自患者关节置换中切除的股骨头、颈和股骨髁松质骨(患者及家属同意后)，通过制备、培养及鉴定人成骨细胞^[21] ，并且对医用级硫酸钙/胶原膜复合型多孔生物支架进行降解，将培养好的人成骨细胞分别与复合支架降解产物浸提液(实验组)和含体积分数10%新生牛血清的DMEM培养液(对照组)相容培养，验证该复合型多孔支架降解产物对人成骨细胞的生物相容性。结果发现，通过MTT测定人成骨细胞体外增殖过程，发现实验组增殖速度略高于对照组，两组均是在第3-5天里增殖最快，前后增殖相对较慢，这也和人成骨细胞的增殖规律相一致，但两组无统计学差别，表明医用级硫酸钙/胶原膜复合型多孔生物支架降解产物对人成骨细胞的增殖、形态及生长无影响^[22] 。
人成骨细胞与支架复合培养只是材料生物相容性评价的一个方面，相容后细胞是否具有正常的生理功能是反映支架生物相容性最重要的证据。而碱性磷酸酶是人成骨细胞分化成熟的重要标志之一，也是说明人成骨细胞必不可少的参数之一^[23] 。实验通过测定人成骨细胞的碱性磷酸酶活力发现，两组碱性磷酸酶/总蛋白差异无显著性意义(P=0.465)，表明医用级硫酸钙/胶原膜复合型多孔生物支架降解产物没有影响人成骨细胞的正常生理功能。
所以，医用级硫酸钙/胶原膜复合型多孔生物支架降解产物既不影响人成骨细胞的增殖生长，也不影响其正常生理功能，具有较好的生物相容性，是骨组织工程领域里一种新型的、安全的非金属植入性支架材料，降解后的代谢产物不会降低聚合物周围的pH值，不会影响细胞和组织的生长发育^[24] ，不会引起纤维化，以及发生周围组织的免疫反应，植入后较易吸收替代，长期滞留于体内不会妨碍骨组织的改建和完全修复等，可塑性较好且经济实用，有望作为一种新的骨科植入材料应用于临床^[25] 。

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医用级硫酸钙是一种骨引导性材料，主要作为空隙的填充物，它能恢复骨的形态轮廓，阻止软组织长入，它为血管和成骨细胞的长入提供了骨引导性基质。当医用硫酸钙被吸收时，新骨塑性并恢复解剖学特点和结构特性。医用硫酸钙支架孔径分布在150-300μm之间，孔洞之间互相连通，而且材料内部微孔丰富、分布均匀，呈现疏松珊瑚状结构，这种结构类似于生物活体的松质骨构架，它有利于骨组织的长入和材料自身的生物降解。经过相关测试计算，多孔支架平均孔隙率为62.59%-79.36%，抗压强度为27-53MPa（正常人体骨组织的生物力学强度松质骨为7.09MPa、密质骨177-221MPa），其最重要的优点是其自然吸收速度与新骨形成速度相当。随着医用硫酸钙植入物的吸收，新骨也逐渐恢复解剖性质及结构特点。医用级硫酸钙/胶原膜复合型多孔生物支架是由医用硫酸钙支架和Ⅰ型胶原蛋白复合而成，该胶原膜有部分类似于天然骨的微结构成分与特征，同时具备了胶原蛋白膜的屏障作用和硫酸钙诱导新骨生成的作用，Ⅰ型胶原蛋白涂层于支架材料的微孔表面以后，成骨细胞在其表面显现出良好的黏附性和增殖活性，所以Ⅰ型胶原蛋白可作为骨黏附分子和骨特异性生长因子的良好载体，它与基质材料复合构建的支架具有很好促进新骨组织形成的能力。但此种复合物在体内降解过程并不十分明确，并且其降解产物对人成骨细胞的影响研究也较少，故实验从此处入手。
　　现阶段，体外细胞复合培养法是一种评价支架生物相容性的重要方法。实验取材来自患者关节置换中切除的股骨头、颈和股骨髁松质骨（患者及家属同意后），通过制备、培养及鉴定人成骨细胞，并且对医用级硫酸钙/胶原膜复合型多孔生物支架进行降解，将培养好的人成骨细胞分别与复合支架降解产物浸提液（实验组）和含体积分数10％新生牛血清的DMEM培养液（对照组）相容培养，验证该复合型多孔支架降解产物对人成骨细胞的生物相容性。结果发现，通过MTT测定人成骨细胞体外增殖过程，发现实验组增殖速度略高于对照组，两组均是在第3-5天里增殖最快，前后增殖相对较慢，这也和人成骨细胞的增殖规律相一致，但两组无统计学差别，表明医用级硫酸钙/胶原膜复合型多孔生物支架降解产物对人成骨细胞的增殖、形态及生长无影响。

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